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轉(zhuǎn)座子整合穩(wěn)定細胞株

產(chǎn)品描述
周期報價
案例展示

名字定義

      轉(zhuǎn)座因子(Transposable element,簡稱TE),又稱“跳躍基因”,是指從基因組的一個位置移動到另一個位置的DNA序列。這類因子最早由遺傳學(xué)家芭芭拉·麥克林托克于50多年前發(fā)現(xiàn)。起初,生物學(xué)家對麥克林托克的發(fā)現(xiàn)持懷疑態(tài)度。然而,在接下來的幾十年里,人們逐漸發(fā)現(xiàn),TE不僅會“跳躍”,而且?guī)缀醮嬖谟谒猩矬w(包括原核生物和真核生物)中,而且通常數(shù)量巨大。例如,TE約占人類基因組的50%,占玉米基因組的90%。



轉(zhuǎn)座子類型

根據(jù)轉(zhuǎn)座機制,轉(zhuǎn)座因子可分為兩類:
1.I類轉(zhuǎn)座因子(也稱為逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子)
2.II類轉(zhuǎn)座因子(也稱為DNA轉(zhuǎn)座子)。
 


圖1:不同真核生物基因組中逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子和DNA轉(zhuǎn)座子的相對數(shù)量。
 
該圖顯示了DNA轉(zhuǎn)座子和逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在各物種中占轉(zhuǎn)座因子總數(shù)的百分比。(Sc:釀酒酵母;Sp:粟酒裂殖酵母;Hs:智人;Mm:小家鼠;Os:水稻;Ce:秀麗隱桿線蟲;Dm:果蠅;Ag:岡比亞按蚊(瘧蚊);Aa:埃及伊蚊(黃熱病蚊);Eh:溶組織內(nèi)阿米巴;Ei:入侵內(nèi)阿米巴;Tv:陰道毛滴蟲。)

I類轉(zhuǎn)座因子(TE):逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子 
      I類轉(zhuǎn)座子也稱為逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。它們通過“復(fù)制粘貼Ctrl C+V”機制進行轉(zhuǎn)座(圖1)。它們首先將自身復(fù)制為RNA轉(zhuǎn)錄本,然后依靠逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄回DNA,最終插入新的靶位。這與逆轉(zhuǎn)錄病毒(如HIV)的復(fù)制方式類似。
 
      I類轉(zhuǎn)座子不編碼轉(zhuǎn)座酶。I類TE被認為是具有復(fù)制性的,因為它們每次跳躍都會復(fù)制自身。這增加了TE的拷貝數(shù)量,同時也增加了宿主基因組的大小。
 
      I類轉(zhuǎn)座子有兩種類型:具有長末端重復(fù)序列(LTR)的轉(zhuǎn)座子和不具有長末端重復(fù)序列(非LTR轉(zhuǎn)座子)。LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的結(jié)構(gòu)和復(fù)制機制與逆轉(zhuǎn)錄病毒相似。它們包含兩個基因: gag和pol。pol多聚蛋白編碼LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座所需的逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶。非LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子包含兩個開放閱讀框(ORF),通常以poly(A)結(jié)尾。ORF2編碼內(nèi)切酶和逆轉(zhuǎn)錄酶活性。 
 


圖 1:逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座概述。逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子通過“復(fù)制粘貼Ctrl C+V”機制進行移動。
 
II類TE:DNA轉(zhuǎn)座子
      II類轉(zhuǎn)座子也稱為DNA轉(zhuǎn)座子,因為它們在移動時不需要RNA中介。大多數(shù)II類轉(zhuǎn)座子具有非復(fù)制性的“剪切粘貼Ctrl X+V”轉(zhuǎn)座機制:它們首先從一個位置切除自身,然后插入到另一個位置(圖2)。II類轉(zhuǎn)座子的兩端均有長末端重復(fù)序列(LTR)。 
 

圖 2:DNA 轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座概述。為了移動轉(zhuǎn)座子,首先轉(zhuǎn)座酶與轉(zhuǎn)座子的長末端重復(fù)序列 (LTR) 結(jié)合,誘導(dǎo)雙鏈斷裂,并將轉(zhuǎn)座子從供體 DNA 上切除。留下 DNA 足跡。當(dāng)轉(zhuǎn)座子-轉(zhuǎn)座酶復(fù)合物找到其靶位點時,它會整合,從而產(chǎn)生靶位點重復(fù) (TSD)。
 


實驗室中常用的DNA轉(zhuǎn)座子

      雖然轉(zhuǎn)座子有很多不同的類型,但DNA轉(zhuǎn)座子在實驗室中用于基因組操作最為常見。在實驗室中使用轉(zhuǎn)座子時,轉(zhuǎn)座酶基因以反式形式提供,以便將目標基因插入轉(zhuǎn)座子的長末端重復(fù)序列(LTR)之間,類似于病毒載體的包裝過程。  

      常見的三種適合用作研究工具的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng):睡美人Sleeping beauty、PiggyBac和Tol2。 

1.睡美人Sleeping beauty,簡稱SB
      睡美人是一種合成的轉(zhuǎn)座因子,由魚類中發(fā)現(xiàn)的mariner。睡美人首選的整合靶位是TA二核苷酸,被轉(zhuǎn)座酶切割后,它會在切除位點的末端序列上留下CAG DNA足跡。它的貨物容量>100 kB,但整合效率會隨著貨物大小而降低。睡美人通過哺乳動物基因組進行整合,其整合特征接近隨機。SB在脊椎動物中很活躍,在人類細胞中的整合速度與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體相似。SB轉(zhuǎn)座酶的高活性版本SB100X的效率比第一代SB轉(zhuǎn)座酶高~100 倍。 hySB100x在SB100X的基礎(chǔ)上進行了改進,轉(zhuǎn)座活性提高了 30%。

2.piggyBac
      piggyBac是在菜青蟲中發(fā)現(xiàn)的 ,它的靶位是 TTAA,與其他轉(zhuǎn)座子不同,它在切除后不會留下 DNA 足跡序列。piggyBac可以裝載超過100 kB的DNA,并且在酵母、植物、昆蟲和哺乳動物細胞(包括人類細胞)中體外和體內(nèi)均有活性。piggyBac傾向于在轉(zhuǎn)錄起始位點、CpG 島和 DNaseI 高敏位點進行整合。與睡美人一樣,piggyBac在人類細胞中的整合效率與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體相似。與密碼子優(yōu)化的野生型piggyBac轉(zhuǎn)座酶相比,高活性PB轉(zhuǎn)座酶 (hyPB)在哺乳動物細胞中的活性高約10倍。 

3.Tol2
      Tol2是第一個在脊椎動物中報道的活性 DNA 轉(zhuǎn)座子。它是在日本青鳉魚中發(fā)現(xiàn)的,因為它插入到青鳉魚的酪氨酸酶基因中導(dǎo)致了白化病。與睡美人(Sleeping Beauty)和piggyBac不同,Tol2 的首選整合位點 TNA(C/G)TTATAA(G/C)TNA 具有較弱的共識序列。Tol2 可以將10-11 kB的DNA 遞送到哺乳動物細胞中而不會降低效率,最大載量約為200 kB。與piggyBac類似,Tol2也傾向于在轉(zhuǎn)錄起始位點、CpG 島和 DNaseI 高敏位點進行整合。Tol2 僅在脊椎動物中活躍,在人類細胞中的整合效率低于piggyBac和睡美人。Minimal Tol2或miniTol2是原始Tol2的截短版本,其轉(zhuǎn)座活性提高了約 3 倍。

Sleeping Beauty (SB)

piggyBac (PB)

Tol2

Species of origin

Salmonid fish

Cabbage looper moth

Medaka fish

Classification

Tc1/mariner superfamily

PB superfamily

hAT superfamily

Transposable element

~1.6 kb long

~2.5 kb long

~4.7 kb long

Terminal regions

IR/DRs of ~ 230 bp

35–63 bp with outer TIRs and inner subterminal IRs

150–200 bp containing the TIRs and subterminal regions

Transposase

340 aa

594 aa

649 aa (most active isoform)

Footprint

CAG

None

Variable

Target site preference

TA

TTAA

Weak consensus sequence

TNA(C/G)TTATAA(G/C)TNA

Target site duplication

TA

TTAA

8 bp

Activity in species

Various vertebrates

Vertebrates, insects, plants, yeast

Various vertebrates

Efficiency in human cells

Comparable to retroviral vectors

Comparable to retroviral vectors

Lower than PB and SB

Cargo capacity

>100 kb

>100 kb

>100 kb

Overproduction inhibition

Yes

To some extent

Lower than PB and SB

Integration profile

Close-to-random

Biased towards TSSs, CpG islands and DNaseI hypersensitivity sites

Biased towards TSSs, CpG islands and DNaseI hypersensitivity sites

Most common parental plasmid

pT2

pXL-BacII

pTol2, miniTol2

Most hyperactive transposase

hySB100X

hyPB

hTol2-M

Vectors for transposon delivery

Plasmid DNA, pFAR, MC,

Plasmid DNA, dbDNA,

Plasmid DNA

non-integrative viral vectors, nanoparticles

non-integrative viral vectors, nanoparticles

Vectors for transposase delivery

Plasmid DNA, mRNA, SNIM RNA,

Plasmid DNA, mRNA,

Plasmid DNA, mRNA,

recombinant protein (hsSB), non-integrative viral vectors,

non-integrative viral vectors,

recombinant protein (His-Tol2)

nanoparticles

nanoparticles

 

Clinical trials

Yes

Yes

No




常見應(yīng)用

1.轉(zhuǎn)座子誘變篩選:
      轉(zhuǎn)座子本質(zhì)上是一種致突變元件,這使得它們成為檢測功能喪失或功能獲得突變的誘變篩選的絕佳工具。在這些篩選中,轉(zhuǎn)座子編碼報告基因、誘變盒或條形碼。當(dāng)轉(zhuǎn)座子被遞送到細胞或模型生物中時,它們會插入宿主的基因組中。然后,使用下一代測序檢測轉(zhuǎn)座子插入位點,并進行分析以確定在實驗過程中哪些插入是陽性或陰性選擇的。

2.轉(zhuǎn)基因動物:
      轉(zhuǎn)基因動物通常是通過將DNA直接注射到受精卵的原核中產(chǎn)生的,這會導(dǎo)致該序列隨機地整合到受精卵的基因組中,這個過程高度難以預(yù)測。然而,轉(zhuǎn)座子在注射到受精卵的細胞質(zhì)中后,能夠有效地整合到受精卵的基因組中,而當(dāng)DNA直接注射時,這個過程效率很低。睡美人、 piggyBac和Tol2都已被用于生成轉(zhuǎn)基因動物,包括斑馬魚、小鼠、大鼠和兔子。

3.穩(wěn)定細胞株構(gòu)建
      轉(zhuǎn)座子是慢病毒載體構(gòu)建穩(wěn)定細胞株的替代方案,例如用于iPSC 重編程以及基因和細胞治療,并且有可能克服病毒的一些局限性。TE 的有效載荷很大,使用Sleeping Beauty和piggyBac時可達100 kB,這比病毒載體有很大優(yōu)勢(AAV 的有效載荷約為 5 kB,慢病毒的有效載荷約為 8 kB)。轉(zhuǎn)座子也比病毒載體更不容易誘導(dǎo)免疫反應(yīng),并且也更容易和更便宜地生成。兩種傳遞方法都可能發(fā)生因整合而導(dǎo)致的基因破壞,但由于 TE 主要插入基因間區(qū)域,因此基因破壞不太令人擔(dān)憂。

4.SgRNA引導(dǎo)的定點轉(zhuǎn)座
      可以借助于sgRNA來引導(dǎo)定點位置的轉(zhuǎn)座,有報道稱,INTEGRATE系統(tǒng)(引導(dǎo) RNA 輔助靶向插入轉(zhuǎn)座因子)可在細菌中實現(xiàn)高達10 kB大小的 DNA 的約 100% 整合。


穩(wěn)定細胞株構(gòu)建服務(wù)

      科佰生物提供“轉(zhuǎn)座子整合系統(tǒng)”穩(wěn)定細胞株構(gòu)建服務(wù),利用該系統(tǒng),我們已經(jīng)成功構(gòu)建超過400株穩(wěn)定細胞株的模型,有著豐富的經(jīng)驗,歡迎溝通咨詢。

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

病毒感染

Flp-FRT系統(tǒng)

轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)

基因編輯

脂質(zhì)體

電轉(zhuǎn)

慢病毒

適用細胞

部分細胞

幾乎所有細胞

幾乎所有細胞

內(nèi)部4種細胞

幾乎所有細胞

部分細胞

轉(zhuǎn)染/感染效率

隨機整合

-

生物安全等級

BL1

BL1

BL2

BL1

BL1

BL1

基因裝載能力

-

-

<4-5k

-

-

-

陽性率

周期

基因合成

2-3

2-3

2-3

2-3

2-3

2-3

病毒包裝

-

-

1

-

-

-

混合克隆篩選

1-2

1-2

1-2

1-2

1-2

1-2

單克隆篩選

>3

>3

>3

可選

可選

>3

合計

> 8-10

> 8-10

>9-11

5-7

5-7

> 8-10

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